Журнал о Медицине
rss новости rss статьи rss все архив
Словарь научных терминов

Электронная микроскопия

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ, совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов (ЭМ) - приборов, в к-рых для получения увелич. изображений используют электронный пучок. Э. м. включает также методики подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа результирующей информации. Различают два гл. направления Э. м.: трансмиссионную (просвечивающую) и растровую (сканирующую), основанных на использовании соответствующих типов ЭМ. Они дают качественно разл. информацию об объекте исследования и часто применяются совместно. Известны также отражательная, эмиссионная, оже-электронная, лоренцова и иные виды Э. м., реализуемые, как правило, с помощью приставок к трансмиссионным и растровым ЭМ.

Некоторые основные понятия. Электронный луч -направленный пучок

ускоренных электронов, применяемый для просвечивания образцов или возбуждения в них вторичных излучений (напр., рентгеновского). Ускоряющее напряжение- напряжение между электродами электронной пушки, определяющее кинетич. энергию электронного луча. Разрешающая способность (разрешение) -наименьшее расстояние между двумя элементами микроструктуры, видимыми на изображении раздельно (зависит от характеристик ЭМ, режима работы и св-в образцов). Свет -лопольное изображение - увелич. изображение микроструктуры, сформированное электронами, прошедшими через объект с малыми энергетич. потерями [структура изображается на экране электроннолучевой трубки (ЭЛТ) темными линиями и пятнами на светлом фоне]. Темнополь-ное изображение формируется рассеянными электронами (основной пучок электронов при этом отклоняют или экранируют) и используется при изучении сильнорассеивающих объектов (напр., кристаллов); по сравнению со светлопольным выглядит как негативное.
Хроматическая аберрация - снижение скорости электронов после просвечивания объекта, приводящее к ухудшению разрешения; усиливается с увеличением толщины объекта и уменьшением ускоряющего напряжения. Контрастирование (химическое и физическое) - обработка исследуемых образцов для повышения общего контраста изображения и(или) выявления отд. элементов их структуры. Оттенение - физ. контрастирование микрочастиц, макромолекул, вирусов, состоящее в том, что на образец в вакуумной установке напыляется тонкая пленка металла; при этом "тени" (ненапыленные участки) прорисовывают контуры частиц и позволяют измерять их высоту. Негативное контрастирование-обработка микрочастиц или макромолекул на пленке-подложке р-рами соед. тяжелых металлов (U и др.), в результате чего частицы будут видны как светлые пятна на темном фоне (в отличие от позитивного контрастирования, делающего темными сами частицы). Ультрамикротом (ультратом) - прибор для получения ультратонких (0,01-0,1 мкм) срезов объектов с помощью стеклянных или алмазных ножей. Реплика- тонкая, прозрачная для электронов пленка из полимерного материала либо аморфного углерода, повторяющая микрорельеф массивного обьекта или его скола. Сканирование- последоват. облучение изучаемой пов-сти узким электронным лучом - зондом с помощью развертки (в трансмиссионных приборах все поле зрения облучается одномоментно). Развертка- периодич. отклонение электронного луча по осям X и Y с целью формирования электронного растра. Растр - система линий сканирования на пов-сти образца и на экране ЭЛТ.

Трансмиссионная микроскопия реализуется с помощью трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопов (ТЭМ; рис. 1), в к-рых тонкопленочный объект просвечивается пучком ускоренных электронов с энергией 50-200 кэВ. Электроны, отклоненные атомами объекта на малые углы и прошедшие сквозь него с небольшими энергетич. потерями, попадают в систему магн. линз, к-рые формируют на люминесцентном экране (и на фотопленке) светлопольное изображение внутр. структуры. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что соответствует увеличениям до 1,5 х 106 раз. Рассеянные электроны задерживаются диафрагмами, от диаметра к-рых в значит, степени зависит контраст изображения. При изучении сильнорассеивающих объектов более информативны темнопольные изображения.
Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. При исследовании тонких пленок и срезов полимерных материалов и биол. тканей контраст возрастает пропорционально их толщине, но одновременно снижается разрешение. Поэтому применяют очень тонкие (не более 0,01 мкм) пленки и срезы, повышая их контраст обработкой соед. тяжелых металлов (Os, U, Pb и др.), к-рые избирательно взаимод. с компонентами микроструктуры (хим. контрастирование). Ультратонкие срезы полимерных материалов (10-100 нм) получают с помощью ультрамикротомов, а пористые и волокнистые материалы предварительно пропитывают и заливают в эпоксидные компаунды. Металлы исследуют в виде получаемой хим. или ионным травлением ультратонкой фольги. Для изучения формы и размеров микрочастиц (микрокристаллы, аэрозоли, вирусы, макромолекулы) их наносят в виде суспензий либо аэрозолей на пленки-подложки из формвара (поливинилформаль) или аморфного С, проницаемые для электронного луча, и контрастируют методом оттенения или негативного контрастирования.

http://www.pora.ru/image/encyclopedia/3/6/6/18366.jpeg

Рис. 1. Схема устройства трансмиссионного электронного микроскопа: 1 - электронная пушка; 2 - конденсор; 3 -образец; 4, 5- объектив и его диафрагма; 6, 7- промежуточная и проекционная линзы; 8 -смотровое окно; 9 - люминесцентный экран; 10 - фотокамера с затвором; 11 - вакуумная система.

Для анализа металлич. фольги, а также толстых (1-3 мкм) срезов др. материалов используют высоко- и сверхвысоковольтные ТЭМ с ускоряющими напряжениями соотв. 200-300 и 1000-3000 кВ. Это позволяет снизить энергетич. потери электронов при просвечивании образцов и получить четкие изображения, свободные от хроматич. аберрации.
Структура гелей, суспензий, эмульсий и биол. тканей с большим содержанием воды м. б. исследована методами криорепликации: образцы подвергают сверхбыстрому замораживанию и помещают в вакуумную установку, где производится раскалывание объекта и осаждение на пов-сть свежего скола пленки аморфного С и оттеняющего металла. Полученная реплика, повторяющая микрорельеф пов-сти скола, анализируется в ТЭМ. Разработаны также методы, позволяющие делать ультратонкие срезы замороженных объектов и переносить их, не размораживая, в ТЭМ на криостолик, сохраняющий т-ру объекта в ходе наблюдения на уровне -150 °С (криоультратомия и криомикроскопия).
ТЭМ обеспечивает также получение дифракц. картин (электронограмм), позволяющих судить о кристаллич. структуре объектов и точно измерять параметры кристаллич. решеток (см. также Электронография). В сочетании с непосредственными наблюдениями кристаллич. решеток в высокоразрешающих ТЭМ данный метод - одно из основных ср-в исследования ультратонкой структуры твердого тела.

Растровая (сканирующая) микроскопия. В растровых электронных микроскопах (РЭМ; рис. 2) электронный луч, сжатый магн. линзами в тонкий (1-10 нм) зонд, сканирует пов-сть образца, формируя на ней растр из неск. тыс. параллельных линий. Возникающее при электронной бомбардировке пов-сти вторичные излучения (вторичная эмиссия электронов, оже-электронная эмиссия и др.) регистрируются разл. детекторами и преобразуются в видеосигналы, модулирующие электронный луч в ЭЛТ. Развертки лучей в колонне РЭМ и в ЭЛТ синхронны, поэтому на экране ЭЛТ появляется изображение, представляющее собой картину распределения интенсивности одного из вторичных излучений по сканируемой площади объекта. Увеличение РЭМ определяется как М = L/l, где L и l - длины линий сканирования на экране ЭЛТ и на пов-сти образца.

http://www.pora.ru/image/encyclopedia/3/6/7/18367.jpeg

Рис. 2. Схема устройства растрового электронного микроскопа: 1 - электронная пушка; 2 - конденсор; 3 - отклоняющая система; 4 - конечная линза с корректором астигматизма; 5 - объектный столик; 6 - образец; 7 - вакуумная система; 8 - генератор разверток; 9 - блок управления увеличением; 10 -селектор сигналов (для выбора регистрируемого вторичного излучения); 11 -видеоусилитель; 12,13 - ЭЛТ и ее отклоняющая система; BИ1-BИ3 - потоки вторичных излучений; C1 - C3 - электрич. сигналы; Д13 - детекторы; ЭЛ1, ЭЛ2 - электронные лучи; X, Y - направления сканирования (строчная и кадровая развертки).

Выбор регистрируемого вторичного излучения обусловлен задачей исследования. Основной режим работы РЭМ - регистрация вторичных электронов (ВЭ). Поскольку интенсивность эмиссии ВЭ сильно зависит от угла падения электронного луча на пов-сть, получаемое изображение весьма близко к обычному макроскопич. изображению рельефа объекта, освещаемого со всех сторон рассеянным светом; иначе говоря, формируется топографич. контраст. Эмиссия ВЭ отличается наиб. интенсивностью по сравнению с др. вторичными излучениями. Кроме того, в этом режиме достигается макс. разрешение.
При исследовании неоднородных по составу пов-стей на топографич. изображение ВЭ накладывается дополнит. распределение яркостей, зависящее от ср. атомного номера Z в-ва образца на каждом микроучастке (т. наз. композиционный, или Z-контраст), к-рый проявляется сильнее, если регистрировать не вторичные, а упругорассеянные электроны. Этот режим применяют при исследовании шлифов металлич. сплавов минералов, композиционных материалов и др. объектов, когда топографич. контраст отсутствует и нужно установить композиционную неоднородность пов-сти.
Тонкопленочные образцы (до 1 мкм) просвечиваются электронным лучом насквозь и прошедшие электроны регистрируются детектором, расположенным под объектом. Изображения, получаемые в этом режиме, иногда более информативны, чем обычные ТЭМ-изображения, т.к. свободны от хроматич. аберрации.
В техн. исследованиях используется также регистрация поглощенных электронов в сочетании с приложением рабочих напряжений к изучаемому транзистору или интегральной схеме. Это позволяет получать изображение, отвечающее распределению электрич. потенциалов, и т. обр. выявлять микродефекты в элементах схемы. При этом можно прерывать первичный электронный луч с высокой частотой и визуализировать прохождение по схеме высокочастотных сигналов.
С помощью соответствующих детекторных систем и спектрометров в РЭМ можно регистрировать электромагн. излучения: катодолюминесценцию, тормозное и характеристич. рентгеновские излучения, а также оже-электроны. Получаемые при этом изображения и спектры дают количеств, информацию о локальном элементном составе поверхностных слоев образца и широко применяются в материаловедении (см. Электронно-зондовые методы).
Для изучения структуры пов-сти посредством РЭМ к образцу предъявляется ряд требований. Прежде всего, его пов-сть должна быть электропроводящей, чтобы исключить помехи за счет накопления поверхностного заряда при сканировании. Кроме того, нужно всемерно повышать отношение сигнал/шум, к-рое наряду с параметрами оптич. системы определяет разрешение. Поэтому перед исследованием на диэлектрич. пов-сти путем вакуумного испарения или ионного распыления наносят тонкую (15-20 нм) однородную пленку металла с высоким коэф. вторичной электронной эмиссии (Au, Au-Pd, Pt-Pd). Биол. объекты, содержащие, как правило, большое кол-во воды, перед нанесением покрытия необходимо зафиксировать спец. хим. обработкой и высушить, сохранив естеств. микрорельеф пов-сти (сушка в критич. точке с использованием сжиженных СО2 и N2O, хладонов или вакуумнокриогенными методами).
Разрешающая способность РЭМ определяется многими факторами, зависящими как от конструкции прибора, так и от природы исследуемого объекта. Если образец электро- и теплопроводен, однороден по составу и не обладает приповерхностной пористостью, в РЭМ с вольфрамовыми электродами достигается разрешение 5-7 нм, в РЭМ с электронными пушками на полевой эмиссии - 1,0-1,5 нм.

Перспективные направления развития. К ним относятся: повышение разрешающей способности ТЭМ и РЭМ; совершенствование способов подготовки образцов; разработка методов получения качественно новой информации и повышения чувствительности методов анализа с помощью спек-трометрич. систем; разработка методов компьютерной обработки полученных изображений с целью выявления содержащейся в них количеств. информации о структуре объекта; автоматизация и компьютеризация ТЭМ, РЭМ и соединенной с ними аналит. аппаратуры.
Повышение разрешающей способности микроскопов достигается гл. обр. совершенствованием электронной оптики и применением новых видов электронных пушек. Замена традиционных вольфрамовых термокатодов на ориентир, катоды из LaB6 позволила повысить электронную яркость пушек в 5-7 раз, а переход к пушкам на полевой эмиссии (автоэмиссии) с холодными катодами из монокристаллич. W - в 50-100 раз, что дало возможность уменьшить диаметр электронного зонда и довести разрешение РЭМ до 1 нм, существенно снизив при этом лучевую нагрузку на образец.
Развитие способов подготовки образцов наиб, активно происходит в области электронно-микроскопич. исследования структуры полимерных материалов и влагосодержащих объектов и связано преим. с разработкой криогенных методов (сверхбыстрое замораживание в струе хладона, прижим к металлич. блоку, охлаждаемому жидким Не, низкотемпературное замещение воды орг. р-рителями, криоультратомия, криомикроскопия и др.). Эти методы позволяют избежать нарушений структуры и локального состава образцов, наблюдаемых при хим. фиксации и нанесении электропроводных покрытий.
Такая же цель достигается и при использовании низковакуумного растрового электронного микроскопа (НВРЭМ), дающего возможность исследовать поверхность сильно увлажненных и даже живых объектов без предварит. хим. или криогенной фиксации. В НВРЭМ объектная камера отделена от колонны РЭМ диафрагмой малого диаметра, пропускающей сканирующий электронный луч, но препятствующей проходу молекул газов в высоковакуумную часть колонны. Испускаемые поверхностью ВЭ собираются спец. кольцевым детектором, охватывающим объект. Использование НВРЭМ значительно расширяет исследовательские возможности биологов, почвоведов и материаловедов, позволяя в перспективе создать "полевой" вариант РЭМ.
Мощный прорыв в трансмиссионной Э. м. был сделан в 1980-х гг., когда удалось создать ТЭМ с компьютерным анализатором элементного состава на базе спектрометра энергетич. потерь. Метод спектрометрии энергетич. потерь электронов (EELS - Electron Energy Loss Spectrometry) был известен давно и применялся для микроанализа в трансмиссионно-сканирующем режиме ТЭМ. Однако установка спектрометрич. системы из двух магн. призм и электростатич. зеркала между двумя промежут. линзами (а не под экраном и фотокамерой, как обычно) дала возможность гибко регулировать контраст ТЭМ-изображения, получать безаберрационные изображения толстых (до 1 мкм) срезов, а главное, получить элементно-селективные изображения в диапазоне элементов от В до U с разрешением порядка 0,5 нм и чувствительностью обнаружения до 10-20 г элемента (что соответствует, напр., 150 атомам Са). Такое сочетание характеристик создает большие преимущества Э. м. перед традиционными методами рентгеноспектрального микроанализа при изучении срезов и пленок.
Развитие компьютерной техники обусловило значит. прогресс в области мат. обработки электронных изображений (компьютерная морфометрия). Разработанные аппаратно-программные комплексы позволяют: запоминать изображения, корректировать их контраст; расширять диапазон яркостей путем введения условных цветов; устранять шумы; подчеркивать границы микроучастков, выделять детали микроструктуры в заданном диапазоне размеров и оптич. плотности; проводить статистич. обработку изображений и строить гистограммы распределения микрочастиц по размерам, форме и ориентации; реконструировать объемные изображения структуры композиционных материалов и иных объектов по микрофотографиям серийных срезов; реконструировать объемные изображения микрорельефа и строить профилограммы сечений по стереомикрофотографиям; рассчитывать локальные микроконцентрации элементов по элементно-селективным изображениям и спектрам; определять параметры кристаллич. решеток по электронограммам и др. Кроме того, встроенные в ТЭМ и РЭМ процессоры позволяют гибко управлять микроскопами, значительно снижают электроннолучевое повреждение образцов, повышают достоверность и воспроизводимость результатов анализа микроструктуры, облегчают труд исследователей.
К Э. м. близко примыкает туннельная сканирующая микроскопия.
Первый ТЭМ создали М. Кнолль и Э. Руска в 1928-31; первые РЭМ - М. фон Арденне (1937) и В.К. Зворыкин (1942); первый НВРЭМ выпустила в 1990 фирма "Хитачи". Сканирующий туннельный микроскоп изобрели в 1981 Т. Беннич и X. Рорер (Нобел. премия 1986).

Лит.: Шиммель Г., Методика электронной микроскопии, пер. с нем., М., 1972; Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ, пер. с англ., т. 1-2, М., 1984.

Г. Н. Давидович, А. Г. Богданов.


1. www.pravda.ru: У "Останкино" появился памятник изобретателю телевидения Владимиру Зворыкину
29.07.2013
... подал патент на изобретение кинескопа в 1923 году в США, куда эмигрировал после революции. Он также занимался разработкой таких аппаратов как факс, сканер, приборы ночного видения, электронный микроскоп. ...
2. www.pravda.ru: Исследователи доказали существование кузбасских йети
29.10.2012
... пришли к выводам, исследовав образец под электронным микроскопом, что доставшиеся нам 10 волосков из Азасской пещеры не принадлежали человеку. Они - от млекопитающего, но не от медведя, козла, волка и других животных, которые водятся в Горной Шории", - приводит ...
3. www.yoki.ru: Ученые обнаружили жизненную силу древних лягушек
09.08.2006
... костный мозг в нечаянно расколовшейся кости. Удивившись, она исследовала другие окаменелости и нашла сохранившийся костный мозг у 10 процентов взрослых особей. Проверка с помощью электронного микроскопа подтвердила, что оригинальная структура костного мозга сохранилась, так же как и гигантские клетки, именуемые остеокластами, которые расположены между костью и костным мозгом. ...
Здоровье и профилактика Акушерство и гинекология Стоматология Красота Зрение Энциклопеди Адреса Реклама
Видео